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细胞转染分析

细胞转染概况

转染是一个涉及将外源核酸引入真核细胞的过程,从而导致宿主细胞基因组的改变。基因组的改变可以通过外源遗传物质的表达或通过内源基因沉默的方式进行。

转染是研究细胞生理学和疾病复杂分子机制的有力工具,因为它可以更多地阐明基因调控和蛋白质功能1。 各种类型的核酸可以转染到哺乳动物细胞中,包括质粒 DNA (pDNA) 和小的非编码 RNA,例如小干扰 RNA (siRNA)、microRNA (miRNA) 和短发夹 RNA (shRNA)2

完整的功能蛋白(例如 Cas9、重组蛋白、抗体)和多肽也可以直接传送到细胞中,为临床应用提供了巨大的潜力3。 从广义上讲,转染方法可以细分为生物方法(例如转导)、物理方法(例如电穿孔、显微注射)和化学方法(例如脂转染、磷酸钙转染)1

转染效率评估

转染效率是样品中获得外来元素的细胞比例,可以使用多种不同的方法进行评估。 首先,转染效率可以通过转染后靶基因或蛋白表达的分析来确认和量化。

该方法评估来自转染细胞群的总基因/蛋白质表达,并且可以通过例如免疫蛋白印迹、实时定量 PCR(实时 qPCR)、报告系统或分子成像进行评估。 转染效率也可以通过确定转染细胞在总细胞群中的比例来评估。

这可以通过将转染基因与荧光报告基因偶联来完成(详情参见:Lux3 FL 和 Exact FL 兼容的荧光蛋白列表),或者将它们放置在单独的传送载体上,或者通过转录/转译报告基因融合方式将它们一起引入4。随后,可以通过使用流式细胞仪或荧光显微镜估计荧光细胞的数量来评估转染效率。

CytoSMART Lux3 FL:实时分析转染效率

活细胞延时成像是一种强大的方法,可用于监测转染的时间过程,为实验研究过程提供有价值的、随时间变化的洞察视野6。 与其他转染效率分析方法(即免疫蛋白质印迹法、流式细胞术或实时 qPCR)相比,活细胞成像和显微镜检查通常为评估外源分子吸收效率提供了更直接和直观的途径。 然而,即使在不同的活细胞成像模式中,也有一些方法能够快速、轻松便捷地提供可靠的结果,同时需要更少的费用。

CytoSMART Lux3 FL 结合了明场和荧光成像,可直接可视化和监测转染细胞对外来元素的吸收和表达(图 1)。 该设备还可以根据荧光表面积或图像中荧光物体的数量自动评估转染效率:

• 表面积:转染效率可以计算为荧光细胞占据的表面积与细胞总表面积之比,由明场通道确定(图 2)

• 对象计数:虽然无法使用集成的对象计数算法直接测量转染效率,但 CytoSMART Lux3 FL 可以计算图像中荧光对象的数量并随时间跟踪荧光对象数量(图 3)

监测转染过程不仅可以检查转染引起的基因表达变化并观察到可能被遗漏的趋势,还可以帮助优化转染方案。 细胞的活力和密度(汇合度)是的影响转染效率的公认因素。活细胞成像可用于在转染前和转染过程中评估细胞健康和汇合情况,以最大限度地提高核酸摄取效率。

图 1 | 使用 BacMam 系统转导的 HepG2 细胞的延时视频。 使用 CellLight Nucleus-RFP BacMam 2.0 和 CellLight Actin-GFP BacMam 2.0 试剂在悬浮液中转导 HepG2 细胞,用于荧光检测细胞核(红色信号)和丝状肌动蛋白(绿色信号)。 使用 CytoSMART Lux3 FL 以 30 分钟的快照间隔拍摄图像。

图 2 | 细胞覆盖图

图 2 | 细胞覆盖图。 HepG2 细胞在组织培养塑料上培养,并用 BacMam-Actin-GFP 和 BacMam-Nucleus-RFP 构建体转导,以分别观察肌动蛋白丝和细胞核的表达。 随时间的总细胞覆盖率用蓝线表示,绿色荧光覆盖率(肌动蛋白丝)表示为绿线,红色荧光覆盖率(细胞核)表示为红线。

图3 对象计数图

图 3 | 对象计数图。 该图显示图像中检测到的荧光物体的数量。 红色荧光物体代表 BacMam-Actin-GFP 的表达,绿色荧光物体代表 HepG2 细胞中 BacMam-Nucleus-RFP 的表达。

CytoSMART Exact FL:转染效率的终点分析

CytoSMART Exact FL 是一款自动双荧光细胞计数器,具有更广阔的视野范围和更高的光学分辨率,可提供准确可靠的转染效率分析。与其他基于显微镜的方法类似,Exact FL 直接可视化样品中转染的荧光标记细胞。然而,与 CytoSMART Lux3 FL 不同的是,它不会生成细胞培养的延时视频。为了测量转染效率,将用含有报告基因(如 gfp)的构建体转染的细胞装入可重复使用/或一次性的计数室中。接着,将样品放置在细胞计数台上,设备会捕获细胞的高分辨率图像。这些图像使用基于人工智能的图像分析软件自动处理,以成功量化获得转染载体的细胞比例。 CytoSMART Exact FL 易于使用、准确且在细胞数量评估中减少了用户间的差异,这使得 CytoSMART Exact FL 成为转染效率终点分析的理想工具。

参考文献

1. Kim, T. K. & Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal. Bioanal. Chem. 397, 3173–3178 (2010).

2. Chong, Z. X., Yeap, S. K. & Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: a technical review. PeerJ 9, e11165–e11165 (2021).

3. Chen, S.-H. et al. Utilization of HEPES for Enhancing Protein Transfection into Mammalian Cells. Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. 13, 99–111 (2019).

4. Boulin, T., Etchberger J.F., & Hobert, O. Reporter gene fusions. in WormBook: The Online Review of C. elegans Biology (2006).

5. Peng, L. et al. A simple, rapid method for evaluation of transfection efficiency based on fluorescent dye. Bioengineered 8, 225–231 (2017).

6. Chernousova, S. & Epple, M. Live-cell imaging to compare the transfection and gene silencing efficiency of calcium phosphate nanoparticles and a liposomal transfection agent. Gene Ther. 24, 282–289 (2017).


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